辣根過氧化物酶（HRP）標記套裝

辣根過氧化物酶（HRP）標記套裝

保存條件：HRP（辣根過氧化物酶）-20度保存，透析袋2－8度處理。其他常溫保存。

產品說明：本套裝是將HRP標記的常用試劑集合為一體而成。本操作流程為經碘的高碘酸氧化法。適合于蛋白等含有氨基物質的標記。特別是抗體的標記。

如果待標記物分子量太小（如小于15KD），可能會穿過透析袋而造成樣品損失。

標記原理：在低PH下使RP經NaIO４氧化后形成的醛基可蛋白等分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進一步用NaBH４還原生成穩定的酶標記物。

操作方法：

一，  標記量的計算：HRP（辣根過氧化物酶）分子量為40KD左右。一般為HRP：待標記物＝2：1到4：1之間。比如抗體IgG分子量一般為150－160KD。則10mg HRP可標記抗體在10mg-20mg之間。

二，  計算好各步反應時間。作好開始標記的準備工作，是從下午開始。將HRP（辣根過氧化物酶）一共10mg加入1ml雙蒸水溶解。溶解后可放－20度存放一個月。如果想作兩次標記，可適當稱量5mg。但并不推薦稱量更小的質量。以免產生更大誤差。而且透析袋一般也只夠兩次用量。

三，  剪切合適長度透析袋，用雙蒸水清洗三次備用。透析袋分寬窄兩種，適合于不同量樣品的透析，請自己安排。稱取21.3mg NaIO４，加入0.5ml雙蒸水溶解(現配現用，濃度為0.2M)，將100mM乙酸鈉（PH4.4）用雙蒸水稀釋100倍成1mM乙酸鈉（PH4.4）。準備待標記物，如果待標記物本身鹽含量很低并且緩沖力差，如生理鹽水，可等二天再準備。如果不確定，將0.2M PH9.5 CB稀釋20倍（請不要一次稀釋完，留1－2ml左右備用），作為透析液，將待標記物裝入透析袋中4℃透析過ye，透析袋適當留長約2ml體積的量以備第二天加入酶（透析袋使用請見附錄）。

四，  以一次標記完為例，如果標記量小，可按比例減小試劑的用量。取0.2ml現配的NaIO４溶液加入HRP溶液中，混勻，避光常溫反應兩小時。裝入透析袋中，在稀釋過的乙酸鈉（PH4.4）溶液中4℃透析過ye（透析袋使用請見附錄）。

五，  第二天早上，如果樣品為固體，可用水溶解，加入1/20體積的0.2M PH9.5 CB，混勻。取出活化好的HRP裝入一適合離心管中，加入50ul  0.2M PH9.5 CB，混勻，立刻加入待標記物中，混勻。避光常溫反應兩小時。

六，  加0.1ml新配的10mg／ml NaBH４液，混勻，常溫半小時。

七，  配制合適的透析液，如生理鹽水或者PBS等。透析酶標記物。

八，  如果有條件進一步純化，可透析半天后去進一步純化，如果不純化，請在4℃透析至少24小時。勤換液。

附透析袋使用方法：

本透析袋已預處理過，用雙蒸水清洗后將水用適當吸一下。就可直接使用。透析袋上下都可以用鐵夾，但如果鐵夾不夠用，下部可用細線或者其他的透析袋夾。

將透析袋輕輕的折上兩到三折。用線或者透析袋夾封住，上面支開，加入待透析物，留一定量的空氣在頂上，并小心的折一折，用鐵夾夾住，輕輕的擠壓，如沒發現有液體流出，可放入透析液中。一般透析可用純凈水瓶去頂使用。用一次性筷子或者其他合適物穿過鐵夾，將透析袋吊在透析液中，補充透析液，使透析液蓋過透析袋中的液面而不要淹過鐵夾下面。